图1 一体化（comprehensive and universal）PGT示意图
01 立于临床 提出问题
染色体病和单基因病是造成我国出生缺陷的重要原因之一，目前全球有7000多种罕见病报到，总的发病率约为1%，约占全部人类疾病的10%，而其中约80%是遗传基因改变造成的遗传病[1-2]。据统计，全世界约有3亿名罕见病患者，中国约有2000万，严重影响身体健康。此外，平衡性染色体结构异常是导致女性复发性流产和不孕不育重要因素[3-4]，其中染色体平衡易位最为常见。据统计，通过对新生儿染色体核型分析发现每370名新生儿中就有一名是肉眼可见的平衡易位携带者[5]，发病率是唐氏综合征的2倍，再加上隐匿性的平衡易位发病率会更高，已知在复发性流产夫妇中发生率最高，每12对夫妇就有1对是因为染色体平衡易位所导致[6]。根据复旦大学附属妇产科医院的染色体结构变异大队列统计，这些患者中约70%~80%为父母遗传性，约20%~30%为新发变异。平衡性染色体结构异常人群基数庞大，埋下了生育隐患，严重影响生殖健康。
对于这些遗传病患者夫妇进行生育干预，目前临床上主要通过胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）技术，也就是我们所说的第三代试管婴儿技术，进行辅助生殖治疗，属于出生缺陷一级预防策略[7-9]。但目前的PGT技术也存在不足，如不同类型的指征（PGT-A、PGT-M、PGT-SR）需要不同的技术方法，甚至相同指征、不同的病种也可能需要不同的技术方法。
02 厚积薄发，积极探索
在2017年时，该研究团队便研发了基于遗传标记的胚胎植入前全基因组单体型连锁分析（preimplantation genetic haplotyping，PGH）技术，该技术能够精准的在胚胎期诊断出“染色体结构异常核型携带”和“染色体正常核型”的胚胎[10-11]，2019年该技术已经获得国家发明专利授权，为国际上该领域首个发明专利。基于PGH技术这一基础，团队继续进行进一步的深入探索，致力于打造一个更加高效、适用于临床的一体化综合性和通用性PGT技术，通过一次检测对胚胎中多个遗传变异进行综合性的精准筛查，且对不同的单基因病和染色体病患者具有通用性，尤其适用于同时患有两种甚至多种遗传病的患者。
为此，研究前瞻性纳入了十余对具有孕育单基因病患儿风险、且一方具有明显染色体结构重组（包括相互易位、罗氏易位和倒位）的同时携带两种遗传变异的夫妇，经体外促排卵后进行PGT治疗。本研究中使用了团队定制的高密度基因芯片对核心家系和胚胎细胞进行全基因组SNP等位基因分型，该芯片具有3万多个定制的中国人群高频SNP等位基因位点，更加适合中国人群。
表1 患者基本病史信息
图2 队列病例遗传家族史
03 缜密分析 力求精准
研究团队自主创建生信分析Pipeline，对数据质控后进行多维度遗传变异解析。在Pipeline中，我们将染色体上每2 Mb的长度定义为一个分析window，在基因组范围内可获得1000多个window，当window中包含2个及以上有效遗传标记位点时有效，根据分析，在所有的window中有效率>98%。对于单基因病SNV或indel变异，Pipeline对夫妇双方和各自一名亲属同时进行核心家系全基因组单体型分析模型构建，然后对胚胎进行全基因组单体型分析，通过胚胎的致病变异附近window的单体型来分析胚胎的基因型。因本研究纳入的病例大多没有先证者，这里的亲属主要是患者的父亲或母亲，具体流程如图3所示。
图3 胚胎基因变异分析流程示意图
对于染色体结构变异，Pipeline中使用cnvPartition算法对胚胎数据的B Allele Frequency和Log R Ratio进行分析，来检测胚胎中不平衡易位/倒位造成的染色体片段缺失或重复，同时分析胚胎中其他染色体的非整倍体，并可检测出染色体UPD和三倍体胚胎。对于胚胎中平衡性结构变异的检测，Pipeline通过对夫妇双方和结构变异携带者一名亲属或一枚不平衡的胚胎进行核心家系全基因组单体型分析模型构建，然后对胚胎进行全基因组单体型分析，通过胚胎两个重排断裂点附件window的单体型来分析胚胎的染色体核型。这里需要注意的是，在使用不同样本构建分析模型时，分析思路不同，具体流程如图4所示。每条染色体上window的分布如图5所示。
图4 胚胎结构变异分析流程示意图
图5 染色体上有效window分布情况
04 防控缺陷 服务临床
本研究中基于SNP-based FHLA的PGT技术是一种综合且通用的检测平台，一次检测能够同时完成多种遗传变异的整合分析，且适用于不同的遗传病，大幅提高了临床诊断效能，为PGT技术的临床应用开辟了新的视野，是目前辅助生殖技术的重要补充。对于染色体结构变异携带者，不仅解决了患者自身的流产生育问题，也有效地阻断了向子代的遗传传递，对于提高子代生殖健康意义重大。此外，该技术适用于同时具有两种甚至多种遗传病的复杂携带者，多种遗传变异无需再分别多次检测，简化了临床实践。该研究技术的另外一个特色是，适用于单基因病无先证者家系。2020年，国际上首例同时阻断单基因病和染色体平衡易位的试管婴儿于复旦大学附属妇产科医院集爱生殖中心诞生。该技术已申报了国家发明专利，一体化的综合性通用PGT技术将在防控出生缺陷、提高子代生殖健康中发挥重要作用，助力健康中国。
本文图片来源于“A comprehensive and universal approach for embryo testing in patients with different genetic disorders. ( PMID: 34323405 )”一文。
研究团队简介
本研究是复旦大学附属妇产科医院徐丛剑教授团队的一项重要原创成果，徐丛剑教授为该论文的通讯作者，孙晓溪教授为共同通讯作者，该团队的核心成员张硕博士为该论文的唯一第一作者。该研究得到了徐丛剑教授上海市科委重大专项和医学创新专项基金的资助。
通讯作者介绍
徐丛剑
复旦大学附属妇产科医院教授、主任医师、博士生导师、院长，复旦大学上海医学院妇产科学系主任，上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室主任，作为负责人承担国家重点研发专项、国家863计划专题项目、“十一五”国家科技支撑计划项目、国家自然科学基金等科研项目近20项。以第一作者或通讯作者在JCO、 Adv Sci等国内外杂志发表论文多篇，其中SCI收录130余篇。以第一完成人获教育部科技进步二等奖、教育部技术发明二等奖等，获发明专利授权8项、实用新型专利授权2项。荣获 “新世纪百千万人才工程”国家级人选、上海市优秀学科带头人、上海市领军人才、上海工匠、上海市五一劳动奖章、全国优秀院长等称号，享受国务院特殊津贴。
孙晓溪
主任医师，医学博士，博士研究生导师，上海集爱遗传与不育诊疗中心副院长。擅长生殖内分泌疾病、不孕症的诊治，以及辅助生育技术。作为课题负责人主持国家自然科学基金、上海市科委基金、上海市自然科学基金等研究，近5年发表学术论文近50篇，参与出版专著5本。曾获2014年度黄浦区专业技术拔尖人才、2017全国妇幼健康科学技术奖自然科学类一等奖、2020年度上海市科学技术奖自然科学奖一等奖。
参考资料：
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